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血清干貨分享:胎牛血清使用中會(huì )出現哪些問(wèn)題
常見(jiàn)問(wèn)題:
如何儲存和解凍胎牛血清?
胎牛血清中為什么會(huì )產(chǎn)生絮狀沉淀?如何避免?
胎牛血清的熱滅活?
細胞培養中出現黑點(diǎn)該怎么做?
小牛血清和胎牛血清有何區別?
1、如何儲存和解凍血清才不會(huì )使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過(guò)程中必須規則地搖晃均勻。
長(cháng)時(shí)間儲存在2-8℃時(shí),血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。因此,推薦在-20℃以下儲存血清,并避免反復凍融。
我們建議血清應保存在-2O℃。若存放于4℃時(shí),請勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶,建議無(wú)菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。
2、血清中包含絮狀沉淀,它們是什么,怎么處理?
沉淀包含纖維蛋白和脂蛋白。這是正常特性,不會(huì )影響產(chǎn)品性質(zhì)。要除去沉淀,離心血清(400g,1-2分鐘)或者簡(jiǎn)單的讓其沉淀在瓶子底部,將血清小心的轉移到另一個(gè)無(wú)菌瓶里(一般不建議采用過(guò)濾的方法除去沉淀,因為沉淀會(huì )堵塞濾膜而無(wú)法過(guò)濾)。大多情況輕輕搖動(dòng)沉淀并加熱至37℃就會(huì )再溶解。所以,使用產(chǎn)品時(shí)要搖動(dòng)并加熱血清至37℃,沉淀會(huì )自然消失。
3、如何避免血清中產(chǎn)生沉淀?
按如下操作可避免沉淀的產(chǎn)生:
(1)解凍血清時(shí),請隨時(shí)將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。
(2) 血清分裝凍存時(shí),須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度與成分均一。
(3) 勿直接由-20℃直接至37℃解凍,因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝結而發(fā)生沉淀。
(4) 勿將血清置于37℃太久,否則血清會(huì )變得渾濁,同時(shí)血清中許多較不穩定的成份也會(huì )因此受到破壞,從而影響血清的品質(zhì)。
(5) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無(wú)須做此步驟。
(6) 若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高,時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻,都會(huì )造成沉淀物的增多。
4、培養基中添加了血清和抗生素后,可長(cháng)期保存嗎?
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時(shí),您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開(kāi)始降解。
5、為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué) 研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時(shí),推薦使用熱滅活血清。
6、有必要做熱滅活嗎?
實(shí)驗顯示,經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對細胞的生長(cháng)只有微小的促進(jìn),或沒(méi)有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量,而造成細胞生長(cháng)速率的降低。
而經(jīng)過(guò)熱處理的血清,沉淀物的形成會(huì )顯著(zhù)的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀(guān)察,像是“小黑點(diǎn)",常常會(huì )讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環(huán)境中,又會(huì )使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物 的分裂擴增。
若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時(shí)間,更確保血清的質(zhì)量!
7、細胞培養中出現黑點(diǎn)是污染嗎?如何處理?
一旦您在細胞培養的過(guò)程中發(fā)現有黑點(diǎn)生成,首先,要肉眼觀(guān)察培養基是否混濁,然后,在鏡下觀(guān)察培養細胞生長(cháng)的狀態(tài),黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細胞被污染,微生物則會(huì )大量繁殖,培養基就會(huì )迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。
如果在鏡下觀(guān)察細胞,生長(cháng)狀態(tài)良好,與黑點(diǎn)出現前相比,沒(méi)有任何變化,那么,黑點(diǎn)的出現可能與以下幾種情況有關(guān):
(1)細胞生長(cháng)過(guò)老,破碎的細胞殘骸;
(2)血清質(zhì)量不好,反復凍融的結果;
(3)配制培養基的pH值偏高,不宜細胞生長(cháng);
(4)配制培養基的水質(zhì)、容器不合格??蓱秒x心、過(guò)濾的方法去除這些黑點(diǎn);
(5)培養原代細胞中出現小黑點(diǎn),可能是原代組織中的雜質(zhì),多次傳代可以消除。
8、細胞培養中如何防止黑點(diǎn)生成?
(1) 盡可能地減少血清凍融次數。
(2) 培養基無(wú)需37℃水浴。
(3) 培養基保持最佳PH值7.0-7.2。
(4) 嚴格控制配制培養基的水質(zhì),容器定期刷洗。
(5) 掌握細胞傳代的最佳時(shí)機,細胞切勿生長(cháng)過(guò)老。
9、小牛血清和胎牛血清有何區別與注意事項?
(1)來(lái)源不同:胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時(shí)候,通過(guò)心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清,新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。
(2)組份與比例不同:兩者所含的促細胞生長(cháng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等
(3)用途與用法不同:某些細胞必需胎牛血清才能生長(cháng),而有些細胞只需小牛血清即可,使用濃度不同,一般在5%-10%,有特殊要求的濃度在20%。
10、血清保存和使用須注意
血清應保存在-5℃至-20℃,若存放在4℃不可超過(guò)一個(gè)月。
解凍血清時(shí) ,應先將血清至于2-8℃冰箱,并經(jīng)常搖勻使之溶解,然后至室溫放置使之升溫,絕對不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中,如放在37℃解凍,顏色加深,粘稠度也會(huì )增加,血清在解凍和熱滅活后,應按用量分裝并于-20℃保存,避免反復凍融。
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