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　　問(wèn)題解析：熒光定量PCR反應結束無(wú)擴增曲線(xiàn)

　　熒光定量 PCR反應結束無(wú)擴增曲線(xiàn)出現這個(gè)問(wèn)題的常見(jiàn)原因，主要可以歸結為以下幾種：

　　反應循環(huán)數不夠：一般建議設置循環(huán)數為 40。

　　程序中未設置信號采集步驟：注意，兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在 72 度延伸階段。

　　引物降解：長(cháng)時(shí)間未使用的引物應先通過(guò) PAGE 電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

　　模板濃度太低：這個(gè)大家減少稀釋度重復實(shí)驗就可以了，一般來(lái)說(shuō)，未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

　　模板降解：無(wú)解，請重新制備模板，可以重復實(shí)驗。

　　溶解曲線(xiàn)形狀異常

　　(1)雜峰在主峰之前，Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體

　　這種情況主要有三個(gè)解決方法：

　　重新設計引物;

　　雜峰為引物二聚體，熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內引物與引物糾纏比引物與模板結合更容易導致的，可以嘗試提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來(lái)進(jìn)行改善;

　　另外，當目的基因表達量極低時(shí)，染料法容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實(shí)驗結果，此時(shí)，建議使用探針?lè )ǘ俊?/p>

　　(2)雜峰在主峰之后，非引物二聚體

　　上圖這種情況就是非特異性擴增，可能是引物特異性不好引起的，也可能是空氣中有氣溶膠污染所導致。

　　大家可以先增加退火溫度再試試看，如果沒(méi)有改善，那么就需要重新更換引物啦。

　　為了避免這種麻煩，BUNSEN本生小編建議大家在進(jìn)行熒光定量 PCR實(shí)驗之前，就對自己的引物做一個(gè)特異性驗證。另外，每次試驗的 NTC(no template control)是一定要做的。

　　(3)只有引物二聚體，無(wú)目的條帶

　　如果擴增片段過(guò)短(小于 80bp)，那么僅通過(guò)融解曲線(xiàn)就很難區分引物二聚/目的條帶。

　　另外，也有可能是 熒光定量 PCR 擴增效率低或者沒(méi)有擴增，體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了。

　　總之，產(chǎn)物長(cháng)度建議大家還是設置在 100 - 200 bp，不要太短了。

　　注：以上資料僅供參考!

　　熒光定量PCR 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿(mǎn)足客戶(hù)的需求。與客戶(hù)的共贏(yíng)，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng )美好的未來(lái)。