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　　實(shí)驗原理：瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗方法及原理
 

　　實(shí)驗方法原理

　　瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的主要區別是：它兼有“分子篩"和“電泳"的雙重作用。

　　瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò )結構，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì )受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應微不足道，現廣泛應用于核酸的研究中。

　　蛋白質(zhì)和核酸會(huì )根據pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個(gè)原理可將其分開(kāi)。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05適合。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100 bp的DNA/片段，其分辨率雖比聚/丙/烯/酰/胺/凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20 kb，利用脈沖電泳，可分離高達107 bp的DNA/片段。

　　DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質(zhì)，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。

　　實(shí)驗材料 DNA

　　試劑、試劑盒 瓊脂糖TBE電泳緩沖液電泳載樣緩沖液/溴/化乙錠(EB)溶液母液DNAGreen

　　儀器、耗材 水平式電泳裝置電泳儀臺式高速離心機恒溫水浴鍋微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相支架照相機及其附件

　　實(shí)驗步驟

　　一、試劑配制

　　1. 5×TBE緩沖液：450 mmol/L Tris-硼/酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用時(shí)將上述儲存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液，可同時(shí)作為電泳及制膠用的緩沖液。

　　二、制膠

　　1. 根椐制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱(chēng)量的瓊脂糖粉(總液體量不宜超過(guò)錐瓶的50%

　　容量)。瓊脂糖粉末與0.5×TBE buffer的比例(w：v)參考表1，常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。

　　瓊脂糖凝膠濃度與線(xiàn)形DNA的分辨范圍

　　2. 在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙，并在膜或紙上扎些小孔，然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時(shí)，當溶液沸騰后，請戴上防熱手套，小心搖動(dòng)錐瓶，使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復數次，直至瓊脂糖溶解。

　　3. 使溶液冷卻至50℃-60℃左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠溶液(終濃度0.5 μg/ml)或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混勻。

　　4. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5 mm之間。制膠模如下圖所示，小膠倒入25-30 mL左右瓊脂糖溶液，大膠則60-70 mL左右，若需切膠回收，凝膠可適當加厚。

　　5. 在室溫下使膠凝固，大約30分鐘~1小時(shí)。

　　三、上樣

　　1. 取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻(如：1 μl樣品與5 μl 6×上樣緩沖液)，用微量移液槍小心加入樣品槽中。

　　2. 上樣量根據樣品濃度可適當調整，若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò)樣品槽容量(一般小孔40 μl 為上限，大孔200 μl 為上限，具體和制膠膜規格相關(guān))。

　　3. 每加完一個(gè)樣品要更換槍頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。

　　四、電泳

　　1. 加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?10 V，電流在40 mA以上。

　　2. 當條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm時(shí)(約40 min)，停止電泳。

　　3. 紫外下拍照并觀(guān)察。

　　注意事項

　　1. 5×TBE緩沖液放置時(shí)間過(guò)久會(huì )沉淀，因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液，取5×TBE緩沖液貯存液稀釋?zhuān)F配現用。

　　2. 用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統一。

　　3. 瓊脂糖粉在微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，每次當溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱，否則會(huì )引起溶液過(guò)熱暴沸，造成瓊脂糖凝膠濃度不準，也會(huì )損壞微波爐。溶解瓊脂糖時(shí)，必須保證瓊脂糖充分溶解，否則，會(huì )造成電泳圖像模糊不清。

　　4. 凝膠不立即使用時(shí)，請用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。

　　瓊脂糖凝膠電泳本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己，寬仁以待，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿(mǎn)足客戶(hù)的需求。與客戶(hù)的共贏(yíng)，是我們的發(fā)展目標。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng )美好的未來(lái)。