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　　ELISA實(shí)驗—試劑盒實(shí)驗基本知識點(diǎn)

　　基本類(lèi)型:

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗 (以下簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA) ：是酶免疫測定技術(shù)中應用的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原-抗體反應在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

　　用途:

　　根據ELISA所用的固相載體而區分為三大類(lèi)型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一類(lèi)是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱(chēng)為斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA);再一類(lèi)是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱(chēng)為布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中，又根據其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

　　操作程序:

　　1、間接ELISA

　　本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：

　　(1) 材料

　?、?包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;

　?、?DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽(yáng)性DVH參考血清;待檢鴨血清;

　?、?ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

　　(2) 方法步驟

　?、?加抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　?、?加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

　?、?加酶標抗體 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

　?、?加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液

　?、?用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。

　　(3) 結果判定 已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1，而且已知陽(yáng)性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

　　2、雙抗體夾心ELISA

　　本法主要用于檢測大分子抗原?，F以檢測雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。

　?、?加抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　?、?加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液

　?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

　　3、雙夾心ELISA

　　此法與雙抗體夾心ELISA的主要區別在于：它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。

　　此法的基本程序為：

　?、?加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　?、?加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加入酶標抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

　?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

　　4、競爭ELISA

　　此法主要用于測定小分子抗原及半抗原，其原理類(lèi)似于放射免疫測定。

　　其基本程序為：

　?、?抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　?、?加入待檢抗原及一定量的酶標抗原(對照孔僅加酶標抗原)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

　?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

　　被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測;其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合方法。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。

　　5、阻斷ELISA

　　本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬偽狂犬病(PR)及豬胸膜肺炎(AP)的主要檢測方法。

　　下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序：

　?、?100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　?、?用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　?、?加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

　?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

　　本試驗同時(shí)設標準陰、陽(yáng)性血清對照、兔抗AP2型陽(yáng)性對照、空白對照。

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