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知識分享：BUNSEN本生冷凍管的使用要點(diǎn)及安全建議
冷凍管的使用要點(diǎn)：
冷凍管是一種用于低溫保存樣品的實(shí)驗管。常用規格有0.5ml、1.8ml、5ml、10ml等。冷凍管使用不當會(huì )引起冷凍管爆炸，導致危險物質(zhì)泄漏，嚴重時(shí)甚至會(huì )造成人身傷害。
冷凍管也叫菌種保存管。微生物實(shí)驗室常用的細菌保存方法有牛奶法、甘油法、斜面法等。復雜程度不同，效果也大不相同。目前國內大部分實(shí)驗室，實(shí)驗人員自己制作細菌保存管，不僅增加了工作強度，而且由于各種條件的限制，也不能總是令人滿(mǎn)意。
1、需要在生物安全柜內操作，要保證操作的無(wú)菌性，確保菌種不被污染。
2.冷凍管內的小瓷珠顏色可能有所不同，并不意味著(zhù)任何產(chǎn)品都有不同的功能，而是方便用戶(hù)對細菌進(jìn)行編碼和標記。
3.接種前，因下列情況不得使用冷凍管：
A.瓶子出現漏液的情況。
B.冷凍管內的凍存保護液混濁(表示已被污染)。
C.超過(guò)有效保質(zhì)期。
4.小瓷珠一旦從冷凍管中取出，不得以任何理由放回冷凍管中。
5.丟棄用過(guò)或部分用過(guò)的冷凍試管時(shí)，應注意防止生物危害。
冷凍管的使用步驟：
1.從細菌的純培養物中挑選新鮮培養物，制備濁度約為3-4麥克斯韋比的細菌懸液，并接種到菌種儲存管中。
2.擰緊儲存管，來(lái)回轉動(dòng)4-5次，使細菌乳化，不晃動(dòng)。
3.將儲存管儲存在-20-70的冰箱中。
1.使用低溫恒溫器儲存樣品時(shí)，嚴格要求低溫恒溫器應儲存在液氮的氣相中或冰箱中!如果將冷凍管保存在液氮中，液氮會(huì )以一定概率滲入冷凍管內，復蘇時(shí)由于液氮氣化，管內外壓力不平衡，容易造成冷凍管爆裂，具有生物危害性。
2.操作冷凍管復蘇，全程使用安全防護設備。建議穿實(shí)驗服，戴棉手套，在安全的實(shí)驗臺上操作。如有可能，請佩戴護目鏡或防護面罩。請格外小心，因為夏天的室內溫度會(huì )比冬天高。
3.冷凍管廠(chǎng)家認為在冷凍保存細胞的儲存過(guò)程中，冷凍管的冷凍溫度需要均勻。凍結不均勻會(huì )導致冰塞的產(chǎn)生，冰塞會(huì )壓制兩側液體的溫度傳遞，進(jìn)而產(chǎn)生危險的高壓，損壞冷凍管。
4.冷凍樣本量不應超過(guò)冷凍儲存管所需的工作體積。
冷凍管廠(chǎng)家認為細胞的冷凍保存過(guò)程;
1.用預熱的PBS沖洗細胞。棄去PBS后，加入含有EDTA的胰蛋白酶消化液消化細胞(消化液可以薄薄地覆蓋細胞表面，消化液的濃度要根據不同的細胞系進(jìn)行調整)。
2.在37度的消化細胞3-5分鐘，不要過(guò)度消化。
3.一旦細胞從底部分離出來(lái)，可以用含血清的培養基停止消化，用吸管輕輕吹氣，細胞就可以重新懸浮。
4.冷凍管廠(chǎng)家認為離心細胞再懸浮以沉淀細胞，棄去上清液，并用含血清的培養基再懸浮細胞沉淀。
5.計數細胞(建議使用紐鮑爾室)。
6.離心(500 g，5分鐘)細胞再懸浮并丟棄上清液。用適當體積的含血清培養基懸浮細胞。
7.將細胞重懸液與冷凍保存液(60%培養基，20%流式細胞儀，20%二甲基亞砜)以1，333，601的比例混合，然后轉移到冷凍管中。冷凍試管中的細胞濃度應為15106個(gè)細胞/毫升。
8.冷凍管廠(chǎng)家認為含有細胞的冷凍管應以1 K/min的冷卻速度冷凍。上述要求可通過(guò)將冷凍管插入裝有異丙醇的冷凍箱室中，并將其放入70的冰箱中來(lái)實(shí)現。如果冷凍溶液中有其他類(lèi)型的樣品，冷凍管應直接在20、70或液氮的氣相中冷凍。為了保證每個(gè)樣品的冷凍效果均勻，4毫升和5毫升的Cryo.s管需要在20冷凍過(guò)夜，然后轉移到70或液氮的氣體層。
9.然后將冷凍儲存管轉移到液氮罐中。為了避免污染(如支原體)并考慮安全預防措施的要求，建議將Cryo.s冷凍管放置在液氮上方的氣體層中，而不是液氮層中。
冷凍管廠(chǎng)家認為細胞復蘇過(guò)程：
1.從液氮罐中取出冷凍管后，立即放入37的水浴中解凍，解凍時(shí)間約為1-2分鐘。解凍時(shí)，需要不斷搖動(dòng)冷凍管，使其盡快融化。這一步解凍過(guò)程越快越好。
2.冷凍管廠(chǎng)家認為將解凍后的細胞懸液轉移到15 ml離心管中，需要立即加入一定量的含血清培養基進(jìn)行混合。
3.離心(500 g，5分鐘)細胞再懸浮并丟棄上清液。用適當體積的含血清培養基重新懸浮細胞沉淀，然后將其分裝到一個(gè)或多個(gè)細胞培養瓶中。
4.請遵循細胞接種的推薦濃度。
5.在接下來(lái)的12小時(shí)內，細胞需要在靜止狀態(tài)下培養。
6.冷凍管廠(chǎng)家認為細胞更換可在24-48小時(shí)后進(jìn)行。
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