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ELISA實(shí)驗出現“花板"現象大探秘 !
酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。該實(shí)驗因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡(jiǎn)單，可大批量操作而廣泛應用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而，“花板"現象的出現，往往會(huì )給實(shí)驗者判讀結果帶來(lái)麻煩。所謂“花板"，就是空白、陰性、陽(yáng)性對照及室內質(zhì)控孔結果正常，而標本孔的OD值卻偏高，弱陽(yáng)性結果較多。筆者對“花板"現象進(jìn)行了分析和總結，認為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過(guò)程也會(huì )導致。
1、花板原因大多在樣品
所謂“花板"，就是空白、陰陽(yáng)性對照及室內質(zhì)控孔結果正常，而標本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質(zhì)控結果正常而標本孔異常，是因為樣品本身的原因，大部分或全部標本孔的OD值偏高，很可能是因為樣品中某些共有的物質(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實(shí)驗的過(guò)程中未被除去。
1.1、 待測血清中混有紅細胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著(zhù)在聚乙烯孔內不易洗凈，實(shí)驗表明在較高的離心轉速(3000 /min)和較長(cháng)的離心時(shí)間(>10 min)之下，血液標本被充分地離心分離之后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時(shí)避免加入紅細胞和纖維蛋白，避免這兩種干擾物質(zhì)對實(shí)驗結果的影響，就可避免“花板"情況。
1.2、 高IgG血癥 在實(shí)際工作中，檢測丙肝的實(shí)驗出現花板的情況較多，原因之一是因為目國內外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理，間接法的一個(gè)重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對聚苯乙烯有較強的吸附力，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽(yáng)性。
2、解決辦法主要在洗滌
聚苯乙烯因其具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實(shí)驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過(guò)洗滌清除在反應過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過(guò)程中雖不是一個(gè)反應步驟，但卻決定著(zhù)實(shí)驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細胞或纖維蛋白原，可以在加樣離心時(shí)得到控制，同樣也可以通過(guò)適當增加洗滌次數和浸泡時(shí)間減輕或避免對實(shí)驗結果的影響，同樣，對于血液存在的非特異性的IgG,實(shí)驗者很難在加樣時(shí)將其去除，那么解決的時(shí)機就是洗滌過(guò)程。
ELISA在洗滌過(guò)程中需注意以下幾點(diǎn)：
(1)、板要平整，尤其是在用洗板機洗板的過(guò)程中，往往是3排一起洗，如果板不平，就很可能造成洗液有殘留，從而導致非特異性結合不能清除干凈，對實(shí)驗結果造成干擾。
(2)、洗液溫度，實(shí)驗表明，洗液溫度也會(huì )影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過(guò)低時(shí)容易出現“花板"問(wèn)題。因此，保持室溫在20℃-30℃。
(3)、洗液要注滿(mǎn)孔，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現象。
(4)、洗液要新鮮配置，洗液要臨用新鮮配制，放置時(shí)間過(guò)長(cháng)易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。
(5)、洗板次數不夠或洗滌間隔時(shí)間過(guò)短也會(huì )造成由于洗板不凈而造成“花板"。
3、孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)也會(huì )造成“花板"
實(shí)驗室有一段時(shí)間經(jīng)常出現丙肝檢測“花板"現象，究其原因是由于樣本較多，加樣后未及時(shí)放入孵育箱，反應板在室溫呆的時(shí)間過(guò)長(cháng)，即間接增加了孵育時(shí)間，導致孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此，應嚴格控制加樣時(shí)間，加樣后及時(shí)孵育，標本較多時(shí)可分批操作。
此外，有些廠(chǎng)家的試劑顯色液不穩定，使用容易變藍，如在實(shí)驗不仔細檢查，很容易導致“花板"現象的發(fā)生，這也提醒實(shí)驗者應使用新鮮的顯色液，程度的實(shí)驗的準確性。
綜上所述，將ELISA“花板"現象總結為：花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過(guò)程也會(huì )導致。既然原因大多在樣品，那么在樣品交接時(shí)應嚴格按照規定，無(wú)溶血，無(wú)凝血，足量，單個(gè)的溶血樣品雖不致造成“花板"，但血紅蛋白中的血紅素基團，具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性，在以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標記酶的ELISA測定中，易在孵育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應顯色，從而造成假陽(yáng)性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟，充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施。同樣，嚴格按照試劑說(shuō)明孵育，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效減少“花板"次數，從而提高檢測的特異性和準確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢。
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