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BUNSEN本生:ELISA實(shí)驗操作的顯色和比色
更新時(shí)間:2023-07-18瀏覽:456次

  BUNSEN本生:ELISA實(shí)驗操作的顯色和比色


  (一) 顯色

  顯色是ELISA中的后一步溫育反應,此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內,陰性孔可保持無(wú)色,而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。

  適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴格控制,有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間,及時(shí)判斷。

  OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長(cháng)反應時(shí)間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色,顯色反應應避光進(jìn)行,顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉向棕黃色。


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  TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性,宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。

  TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間(12-24小時(shí))不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(cháng)(450nm)測讀吸光值。

  (二)比色

  比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著(zhù)的液體,然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標準96孔的座架中,才可進(jìn)行比色。

  在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。 比色時(shí)應先以蒸餾水校零點(diǎn),測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過(guò)程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。

  其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn),以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進(jìn)行計算。

  比色結果的表達以往通用光密度(oplical density,OD),現按規定用吸光度(absorbence,A),兩者含義相同。通常的表示方法是,將吸收波長(cháng)寫(xiě)于A(yíng)字母的右下角,如OPD的吸收波長(cháng)為492nm,表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

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