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　　實(shí)驗原理：做ELISA實(shí)驗時(shí)如何操作?
 

　　ELISA實(shí)驗原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結合，此種結合不會(huì )改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。

　　酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色氧化型，出現顏色反應。

　　因此，可通過(guò)底物的顏色反應來(lái)判定有無(wú)相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過(guò)ELISA檢測儀進(jìn)行定量測定，這樣就將酶化學(xué)反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

　　ELISA實(shí)驗步驟及注意事項:

　　1、固相載體選擇

　　聚苯乙x：具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。

　　聚氯乙x：聚氯乙x對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙x高，但空白值也略高。

　　良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。

　　2、包被

　?、侔蹇椎倪x擇：ELISA別的微孔板。

　?、诳贵w選擇：選擇支持ELISA實(shí)驗的抗體，根據推薦濃度稀釋或摸索適濃度。

　?、郯?strong>緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

　?、馨粶囟龋?-8 ℃過(guò)夜包被或室溫(37℃)包被2h。

　?、莅粷舛龋喊粷舛入S載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

　　3、封閉

　?、侔恢笠欢ㄒ⒓捶忾](封閉非特異性抗體)。

　?、谶x擇效果較好的封閉劑(細胞培養BSA、Tween等)。

　　4、加樣及孵育

　?、偌訕訒r(shí)應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

　?、诜跤臅r(shí)間及溫度參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。如有條件，建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉速在500±50rpm。

　?、蹤z測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴格根據說(shuō)明書(shū)提示。

　?、芟窗鍖τ贓LISA來(lái)說(shuō)，是其關(guān)鍵的一步，保證ELISA的特異性。

　?、莘獍迥ひ欢ㄒ淮我粨Q，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

　　5、顯色和終止

　?、偈褂眯铏z查，底物在加入96孔板之應為無(wú)色透明。

　?、陲@色底物需現配現用，避免污染。

　?、鄯跤龝r(shí)間，說(shuō)明書(shū)上為參考范圍，具體需要根據實(shí)驗條件自行摸索?？蓞⒖紭饲鷿舛却罂椎念伾?，變?yōu)樗{色較明顯時(shí)即可。

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