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BUNSEN本生——酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作要點(diǎn)
更新時(shí)間:2023-03-21瀏覽:457次

  BUNSEN本生——酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作要點(diǎn)

  一、摘要:

  1.標本的采取和保存

  可用作elisa測定的標本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進(jìn)行測定(如血清、尿液),有些則需經(jīng)預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑,而血清標本只要待血清自然凝固、血kuai收縮后即可取得。除特殊情況外,在醫學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時(shí)會(huì )釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。 血清標本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。如在冰箱中保存過(guò)久,其中的可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái),在5天內測定的血清標本可放置于4℃,超過(guò)一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應充分混勻宜輕緩,避免氣泡,可上下顛倒混和,不要在混勻器上強烈振蕩?;鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過(guò)濾,澄清后再檢測。反復凍融會(huì )使抗體效價(jià)跌落,所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應注意無(wú)菌操作,也可加入適當防腐劑。

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  2.加樣

  在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標本,加酶結合物,加底物。加樣時(shí)應將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。 加標本一般用微量加樣器,按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本,然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時(shí)可用定量多道加液器,使加液過(guò)程迅速完成。

  3.試劑的準備

  按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準備實(shí)驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時(shí)放回冰箱保存。

  4. 保溫

  在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結合物后??乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation),有人稱(chēng)之為孵育,在ELISA中似不恰當。 ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì ),只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程,因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。

  溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度,也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí),實(shí)驗表明,兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),產(chǎn)物的生成可達。為加速反應,可提高反應的溫度,有些試驗在43℃進(jìn)行,但不宜采用更高的溫度??乖贵w反應4℃更為*,以形成zui多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng),在ELISA中一般不予采用。

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