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　　細胞培養過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

　　細胞培養是生命科學(xué)實(shí)驗中的基礎實(shí)驗，在細胞生長(cháng)過(guò)程中，很多因素都會(huì )造成細胞生長(cháng)不良。下面BUNSEN本生簡(jiǎn)單歸納一下細胞生長(cháng)不良的原因及對應的解決方案。

　　常見(jiàn)問(wèn)題一：為什么細胞解凍后缺少活力，活細胞占比較低?

　　這種現象可能主要由以下幾種原因所導致：

　　1.培養物凍存液等質(zhì)量欠缺。

　　解決方案：

　　a.確保用來(lái)制備儲存物(凍存液)的起始培養物需要保證其健康、無(wú)微生物污染、處于生長(cháng)對數期后期狀態(tài)。

　　b.收獲細胞時(shí)需要小心翼翼，避免細胞損傷。

　　2.儲存物凍存方法不當

　　解決方案：

　　a.在液氮冷凍細胞時(shí)，確保細胞、培養基和其他試劑的濃度，以及凍存實(shí)驗步驟依照供應商的建議。一般來(lái)說(shuō)，凍存應該緩慢，大約1-3° C/min以減少冰晶形成。

　　b.使用電子可編程或機械冷凍裝置以確保一致的、適當速率的冷凍。

　　c.選擇最合適的細胞冷凍保護劑。如果使用甘油，不要將其存儲在光照下，因為曝光會(huì )使甘油轉化為有對細胞毒性的。

　　3.儲存物保存不當

　　解決方案：

　　a.儲存物應時(shí)刻保持在-130℃，理想情況是置于液氮中，以確保較大的細胞活性。

　　b.如果將細胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到凍存管內，解凍時(shí)會(huì )有凍存管爆炸的風(fēng)險。所以一般儲存在液氮上方的氣相環(huán)境中。

　　4.細胞解凍方法不當

　　解決方案：

　　a.一般來(lái)說(shuō)，細胞應該快速解凍、使用預熱的培養基、盡快移除含有冷凍保護劑的培養基防止細胞活力下降。

　　b.確保小心操作細胞。不要渦旋或高速離心，因為低溫保存后的特別容易受到損傷。

　　常見(jiàn)問(wèn)題二：細胞進(jìn)行解凍或傳代后細胞的附著(zhù)力偏低?

　　這種情況主要是因為濕度過(guò)低致使培養容器上集聚靜電所致。

　　可以通過(guò)適當增加房間濕度，使用防靜電裝置或者用消毒過(guò)的濕毛巾擦拭培養容器外側，來(lái)減低靜電產(chǎn)生。另外試劑混合不均勻，培養瓶轉速等因素也可導致此現象發(fā)生。所以在進(jìn)行細胞培養時(shí)，要確保細胞和所有試劑的溶液混合充分。在使用振蕩培養箱進(jìn)行細胞培養時(shí)，注意設置適宜的轉速。

　　常見(jiàn)問(wèn)題三：為什么細胞生長(cháng)速度緩慢?

　　細胞生長(cháng)過(guò)慢有很多原因，其主要原因如下：

　　1.細胞的傳代次數太多，所以獲得一個(gè)新的、亞培養次數較少的細胞儲存液很有必要。

　　2.未選擇合適的細胞收獲時(shí)機。

　　在使用新的細胞儲存液的同時(shí)，也要把我好適宜的細胞收獲時(shí)機，一般在對數生長(cháng)期的后期是細胞收獲時(shí)間當細胞達到*融合后，由于生長(cháng)過(guò)于擁擠，會(huì )逐漸進(jìn)入緩慢生長(cháng)階段，此時(shí)，細胞的活躍度也會(huì )隨之下降。

　　培養基、血清、緩沖液等質(zhì)量差，或者配方不合理。培養基、血清等培養物質(zhì)是細胞生長(cháng)的主要營(yíng)養來(lái)源，所以其質(zhì)量直接會(huì )影響到細胞的生長(cháng)狀態(tài)。所以高質(zhì)量的培養基及合理的試劑配方維持細胞的良好生長(cháng)具有決定的作用。

　　3.CO2濃度與緩沖系統需求不匹配，導致pH控制不足。

　　一般來(lái)說(shuō)，細胞培養液中緩沖液中NaHCO3的濃度與CO2濃度成正比例關(guān)系。緩沖液中NaHCO3 的濃度高，所需求的CO2濃度也較高;這樣才能達到PH平衡。

　　4.微生物污染，尤其是支原體

　　及時(shí)檢查污染，防止微生物污染，做好支原體、器皿、環(huán)境消毒、支原體清除等工作。

　　5.培養物光敏降解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。

　　如果培養基長(cháng)時(shí)間暴露于熒光將會(huì )導致光敏感培養基組分轉化成細胞毒性自由基和H2O2，從而影響到細胞生長(cháng)甚至細胞凋亡。所以平時(shí)要在暗處保存細胞核培養基，避免熒光暴露。

　　6.不精確的細胞計數方法將導致細胞生長(cháng)不良

　　a.確保計數樣本充分混合，避免局部細胞密度差異影響精確計數

　　b.再次檢查使用血球計數板進(jìn)行細胞計數的所有運算

　　常見(jiàn)問(wèn)題四：為什么細胞生長(cháng)會(huì )不均勻?

　　1.細胞或培養基的混合不充分：在培養基中接入細胞后應當輕搖混勻，在進(jìn)入振蕩培養箱后，保證持續穩定的振幅頻率，避免局部濃度差異。

　　2.在細胞培養過(guò)程中有時(shí)候會(huì )出現同一時(shí)期相同器皿之間細胞生長(cháng)不平衡。

　　這種情況可能是由于培養箱內部的溫度不均一所導致。注意做好以下兩點(diǎn)：

　　a.避免將培養器皿疊放，因為底部的培養器皿最靠近金屬架可能加熱最快。

　　b.如果放在培養箱前部的培養器皿比后面的生長(cháng)慢，要注意保持培養箱的門(mén)盡可能關(guān)嚴，并將前面的培養器皿移到后面。